卵巢類器官的培養方法涉及多個步驟，這些步驟需要精確操作和嚴格的無菌條件。以下是一個詳細的卵巢類器官（以卵巢癌類器官為例）培養方法：

一、取材與預處理

取材：采用無菌器械，保證無菌環境，將新鮮的人卵巢癌活檢組織樣本迅速放入裝有適量預冷收樣培養基（如原代組織保存液）的離心管或錐形管中，并放置在冰上以保持低溫，迅速進行后續處理。

清洗：在生物安全柜中，將組織轉移到培養皿中，用適量的PBS溶液（添加雙抗以防污染）多次沖洗，直至液體變得清澈。此步驟旨在去除組織表面的血液、雜質和潛在污染物。

二、組織處理與細胞解離

去除脂肪與壞死組織：用無菌手術刀剔除脂肪及壞死組織，只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。

組織切割：將腫瘤組織切割成1~2mm3的小塊。此步驟可以留存適量組織用于測序、免疫組化分析和后續的類器官構建等實驗。

細胞解離：收集所有剩余的組織碎片，加入適量的解離培養基（如特定的酶解液），并在37℃條件下解離1~2小時。每隔一段時間（如20分鐘），用移液器進行機械吹打，以促進解離過程。解離完成后，通過細胞篩網（如70μm）過濾懸浮液，以收集解離的細胞。

三、細胞懸液制備與計數

終止消化：向懸浮液中加入適量的預冷培養基（如DMEM/F12含10%FBS）以終止消化反應。

離心與重懸：將懸浮液在4℃條件下以一定離心力（如220g）離心5分鐘。離心后，用適量的培養基（如DMEM/F12）沖洗細胞一次，并再次離心收集細胞沉淀。然后，用適量的培養基重懸細胞，并進行細胞計數，將細胞懸液調整至適當的濃度（如5000個細胞/μL）。

四、類器官培養

基質膠混合：將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍。然后，在冰上以適當的體積比（如7:3）將Matrigel與細胞懸液混合，并輕輕吹打以避免產生氣泡。

接種：從37℃培養箱中取出預熱的培養板（如48孔板），將適量的混合液（如20μL）接種到每個孔中（約含30000個細胞）。注意要接種在孔的中心位置，并確保沒有氣泡和側壁接觸。

固化與培養：將培養板倒置放入37℃，5%CO2的培養箱中孵育一段時間（如20分鐘），以使Matrigel固化并確保細胞的均勻分布。然后，向每個孔中緩慢滴加適量的預熱的類器官培養基，確?；|膠被完全覆蓋。將培養板置于37℃，5%CO2的培養箱中進行培養。每2~3天更換一次培養基，但請注意，用于換液的類器官培養基中不應含有某些可能影響類器官生長的成分（如Y27632）。

五、類器官鑒定與傳代

鑒定：使用顯微鏡觀察類器官的形態結構和大小，以此評估其三維球體形成能力和完整性。同時，可以通過與原組織的HE染色和免疫組化進行對比，或檢測特定標志物（如P53/PAX-8/CK7）的表達情況來進行鑒定。條件允許的情況下，還可以進行全外顯子測序（WES）以獲取更全面的信息。

傳代：當類器官生長到一定階段時，需要進行傳代以維持其生長和活性。傳代步驟包括吸出類器官培養液、機械分離Matrigel、加入適量的胰蛋白酶進行消化、終止消化、離心收集細胞沉淀、用PBS清洗后再次離心、將所得細胞沉淀按照適當的比例（如1:3至1:5）進行傳代等。

六、類器官凍存與復蘇

凍存：取適量的類器官，經過消化、離心后收集細胞沉淀。加入適量的細胞凍存液，重懸細胞后轉入凍存管中。利用程序降溫盒將細胞緩慢降溫至-80℃。第二天，將凍存的卵巢癌類器官轉移到液氮中進行長期儲存。

復蘇：將液氮中凍存的卵巢癌類器官置于37℃水浴鍋中進行解凍，注意控制水浴時間不超過2分鐘。將解凍后的細胞懸液轉入離心管中，加入適量的預冷培養基。在4℃條件下以一定離心力離心后取細胞沉淀。將所得細胞沉淀按照傳代步驟進行處理，完成卵巢癌類器官的復蘇。

注意事項

所有操作需在無菌環境下進行，以避免污染。

使用的試劑和材料應確保無菌且質量可靠。

在操作過程中應注意避免產生氣泡和機械損傷類器官。

定期觀察類器官的生長情況和形態變化，以及時調整培養條件和處理方法。

通過以上步驟，可以成功培養出卵巢癌類器官，并用于后續的實驗研究和應用。同時，這些方法也可以為其他類型的卵巢類器官培養提供一定的參考和借鑒。