使用Cellspace-3D培養肝癌類器官時，需結合其微重力模擬、低剪切力及三維培養技術，通過模擬體內微環境提升類器官的生理相關性，具體操作及優勢如下：

一、技術原理與操作要點

1.微重力環境模擬

旋轉壁容器（RWV）：通過水平旋轉培養室，使細胞懸浮于培養基中，抵消重力沉降效應，形成近似“自由落體”的微重力環境。肝癌細胞在此環境下自發聚集，形成直徑可達500μm的三維球體，內部呈現梯度氧分壓、代謝物濃度及細胞外基質（ECM）沉積，更接近體內腫瘤組織結構。

隨機定位儀（RPM）：通過多軸隨機旋轉分散重力影響，有效重力<0.01g，適合短期實驗（如細胞信號傳導研究）。

2.低剪切力保護

采用層流優化與低速旋轉（<10 rpm），減少機械應力對細胞的損傷，保護細胞膜及細胞間連接。肝癌細胞在微重力環境下通過黏附分子（如E-鈣黏蛋白）自發聚集，形成具有代謝梯度的類器官。

3.三維培養基質選擇

水凝膠支架：使用生物降解水凝膠（如Matrigel、膠原）為類器官提供結構支持，促進細胞-ECM相互作用。

3D打印支架：結合3D打印技術構建定制化支架，模擬腫瘤微環境中的物理屏障。

二、應用優勢

1.腫瘤異質性研究

微重力培養的肝癌類器官可模擬實體瘤的異質性，包含壞死核心與增殖外層。例如，乳腺癌模型中，微重力環境下腫瘤細胞對藥物的耐藥性提升3倍，與上皮-間質轉化（EMT）標志物表達上調相關。

2.藥物篩選與耐藥性評估

在3D肝癌球狀體中測試藥物療效，發現其滲透深度與患者響應率正相關，減少傳統二維模型中的假陰性/陽性結果。例如，PD-1抑制劑在3D模型中的滲透深度可預測患者臨床響應。

3.腫瘤微環境模擬

通過共培養肝癌細胞與基質細胞（如內皮細胞、癌相關成纖維細胞CAFs），模擬腫瘤微環境中的細胞間相互作用，研究腫瘤發生、發展及轉移機制。

4.個體化醫療

利用患者來源的肝癌細胞構建3D模型，指導術后藥物選擇，提高治療成功率。例如，高通量篩選評估患者對靶向藥物（如EGFR抑制劑）的敏感性。

三、實驗設計與挑戰

1.實驗步驟

準備階段：清潔培養室與微載體，配置含生長因子的培養基（如添加EGF、HGF）。

接種與培養：將肝癌細胞懸液與微載體混合，接種至旋轉壁容器，調整旋轉速度（5-10 rpm）與溫度（37℃）。

監測與調整：定期監測細胞密度、活性及代謝物濃度（如乳酸、葡萄糖），根據實驗需求調整氧氣濃度（5% CO?）、pH值（7.2-7.4）等參數。

2.技術挑戰與解決方案

營養擴散限制：球體中心區域易因營養/氧氣不足而壞死。解決方案包括引入微流控灌注系統或聲波操控技術，實現動態補充與代謝物清除。

規模化培養：傳統RWV單次培養體積<50 mL，難以滿足工業級需求。開發模塊化生物反應器陣列（如10×RWV并聯運行），總培養體積達500 mL，實現規模化生產。

實時監測：封閉式培養系統難以實時獲取細胞狀態數據。集成拉曼光譜（代謝物分析）與電阻抗傳感（細胞密度），實現培養過程閉環控制。

四、典型案例

1.藥物療效預測

在3D肝癌球狀體中測試索拉非尼（一線靶向藥物）的療效，發現其滲透深度與患者生存期正相關，指導臨床用藥方案優化。

2.腫瘤轉移機制研究

通過共培養肝癌細胞與內皮細胞，模擬腫瘤血管生成過程，發現微重力環境下腫瘤細胞遷移能力顯著增強，與整合素β1表達上調相關。

3.個性化醫療應用

利用患者來源的肝癌細胞構建3D模型，篩選對免疫檢查點抑制劑（如帕博利珠單抗）敏感的患者群體，提高免疫治療成功率。