在重力效應研究中，人源胃類器官在模擬微重力環境下的培養需結合三維培養技術、微重力模擬設備特性及類器官培養規范，從設備選擇、培養體系優化、實驗操作規范、生物學分析四個方面進行系統設計，以揭示重力變化對胃類器官發育、功能及疾病模型構建的影響。

一、設備選擇與參數校準

1.回轉儀類型：選擇旋轉壁生物反應器（RWV）或隨機定位儀（RPM）模擬微重力環境。RWV通過水平旋轉實現離心力與重力平衡，適用于長期培養（數周至數月）；RPM通過雙軸隨機旋轉快速改變重力矢量方向，適用于短期實驗（如細胞信號通路研究）。

2.關鍵參數：轉速需低速設置（如1-4rpm）以避免剪切力干擾，同時需實時監測重力數值（精度±0.001G）確保環境穩定。

3.培養容器：使用透氣性硅膠膜或中空纖維結構的培養瓶，支持氣體交換并減少流體剪切力（<0.1 dyne/cm2），保護敏感細胞。

二、培養體系優化

1.基質膠與細胞懸液混合：

使用Matrigel或合成聚乙二醇基質，在4℃下過夜解凍，并按7:3體積比與細胞懸液混合，避免產生氣泡。

2.初始接種密度調整至5,000-10,000個細胞/μL，避免過高導致營養不足，過低抑制3D聚集體形成。

培養基配方與動態灌注：

基礎培養基：DMEM/F12補充10% FBS、1× L-glutamine、1× N2、1× B27、50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、50 ng/mL R-spondin 1等生長因子。

動態灌注系統：結合微流控芯片實現營養/氧氣動態供應，避免微重力下液體分層導致的代謝廢物積累。例如，每2-3天更換培養基，并補充抗氧化劑（如NAC）以應對氧化應激。

三、實驗操作規范

1.樣本采集與處理：

樣本來源：手術組織（首選）、腹水/胸腔積液或穿刺活檢組織，需經病理鑒定且腫瘤細胞含量≥10%。

無菌操作：組織離體后10分鐘內浸入保存液，全程密封運輸至實驗室，避免污染。

組織消化：使用膠原酶IV（1 mg/mL）和脫氧核糖核酸酶（0.2 mg/mL）在37℃下解離1-2小時，每隔20分鐘機械吹打促進解離。

2.接種與固化：

種板技術：將20 μL混合液接種于預熱的48孔板中心，避免接觸側壁，倒置培養箱中孵育10-20分鐘使Matrigel固化。

培養基添加：固化后緩慢滴加250 μL預熱培養基，確保基質膠被完全覆蓋，減少邊緣效應。

四、生物學分析

1.形態學與功能驗證：

顯微鏡觀察：使用相差顯微鏡或共聚焦顯微鏡評估類器官形態（致密型、囊泡型、混合型）和完整性，活率需≥50%。

免疫組化與基因檢測：通過HE染色驗證核深染、異常分裂象等腫瘤特征，短串聯重復序列（STR）檢測確認類器官與原腫瘤組織遺傳一致性。

2.微重力效應評估：

細胞骨架分析：定量分析微管重組和F-actin分布變化，揭示微重力對細胞力學特性的影響。

信號通路調控：通過RNA-seq檢測差異基因（如整合素、HIF-1α通路），蛋白組學驗證關鍵通路（如NF-κB、MAPK）活性變化。