封閉類器官培養(yǎng)步驟通常涉及多個(gè)精細(xì)的環(huán)節(jié)，以下是基于基質(zhì)膠法的一般性步驟，以供參考：

一、準(zhǔn)備工作

儀器設(shè)備：準(zhǔn)備CO2培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋或水浴搖床、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷等儀器設(shè)備。

試劑耗材：根據(jù)所要培養(yǎng)的類器官類型準(zhǔn)備相應(yīng)的培養(yǎng)基、緩沖液、消化液、基質(zhì)膠等試劑耗材。例如，人腸癌類器官培養(yǎng)所需的試劑耗材包括人腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、100μm濾篩、15mL離心管、1.5mL EP管若干、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、金屬冰盒等。

二、操作流程

樣本準(zhǔn)備：

將組織放入含有預(yù)冷（2~8℃）組織保存液的取樣瓶中（浸沒整個(gè)組織），4℃條件下從醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室取回。

將取樣瓶消毒后，取出組織放入培養(yǎng)皿中拍照，并登記大小、顏色、軟硬程度、組織類型等信息。

清洗與剪碎：

在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中用2~3mL原代培養(yǎng)緩沖液浸泡組織。

用原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后，將組織剪碎成大約1~3mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。

消化與過濾：

向15mL離心管中加入5倍體積的人腸癌原代組織消化液（消化液體積：組織體積=5:1），在37℃條件下進(jìn)行消化15~30min（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。

取少量液體在顯微鏡下觀察，當(dāng)鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5~50個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)）后，加入3倍體積的原代培養(yǎng)緩沖液終止消化，用槍頭輕柔吹打使液體變渾濁。

使用100μm濾篩進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15mL離心管中，于300g、4℃條件下富集離心5min后移去上清。

加膠、點(diǎn)板與加液：

基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

將細(xì)胞團(tuán)沉淀與基質(zhì)膠混合均勻（不要產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板操作。每孔加入25μL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中4060min成膠，然后添加500750μL類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

三、后續(xù)培養(yǎng)與傳代

培養(yǎng)觀察：將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并定期觀察類器官的生長情況。

傳代操作：當(dāng)類器官達(dá)到一定大小（如直徑在200μm~500μm）時(shí)，可進(jìn)行傳代操作。傳代步驟包括收集、洗滌、消化、重懸、點(diǎn)板和加液等。

收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1~2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

洗滌與消化：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容并靜置或冷凍一定時(shí)間使基質(zhì)膠軟化，然后進(jìn)行離心分離。接著添加類器官傳代消化液進(jìn)行消化，消化成細(xì)胞團(tuán)后終止消化并再次離心。

重懸、點(diǎn)板與加液：將細(xì)胞團(tuán)沉淀與基質(zhì)膠混合均勻后進(jìn)行點(diǎn)板操作，并添加類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

需要注意的是，不同類型的類器官培養(yǎng)步驟可能略有差異，具體應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。同時(shí)，類器官培養(yǎng)過程中需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（如溫度、pH值、氧氣濃度、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子等），以確保細(xì)胞的正常生長和分化。此外，還需要定期觀察和分析類器官的形成和發(fā)展過程，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題并進(jìn)行調(diào)整。