樣本獲取與處理

高質量樣本采集：從神經母細胞瘤患者手術切除的腫瘤組織或者活檢樣本獲取細胞是關鍵的第一步。樣本應盡可能新鮮，在采集后盡快放入合適的保存液，避免組織壞死和細胞活性降低。例如，使用含有抗生素和營養成分的冰冷緩沖液運輸樣本，減少細胞代謝應激。

精細的組織解離：對樣本進行精準的解離，將組織分解為單個細胞或小細胞團。這需要選擇合適的酶，如膠原酶和透明質酸酶，以及控制好酶消化的時間和溫度。過度消化可能會損傷細胞，而消化不足則無法獲得足夠的單細胞懸液用于培養。

培養基和生長因子

特制培養基配方：神經母細胞瘤類器官培養需要一種適合其生長和分化的特殊培養基。基礎培養基成分可以是 DMEM/F12 等，同時要添加如神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）等營養物質，這些因子對神經細胞的存活和分化至關重要。

生長因子的協同作用：多種生長因子的協同作用很關鍵。例如，除了上述的神經生長因子，還需要加入表皮生長因子（EGF）來促進細胞增殖，同時搭配胰島素樣生長因子 - 1（IGF - 1）來調節細胞代謝和分化，使類器官更好地模擬體內神經母細胞瘤的生長環境。

三維培養環境搭建

合適的基質膠選擇：選擇合適的基質膠來模擬體內細胞外基質環境，如 Matrigel 或膠原蛋白。這些基質膠可以為細胞提供支撐，促進細胞間的相互作用和類器官的三維結構形成。例如，Matrigel 可以包裹細胞，使其能夠形成類似體內腫瘤組織的球體結構。

物理環境優化：物理環境包括培養容器的選擇和培養條件的設置。選擇低吸附的培養板可以防止細胞貼壁生長，有利于類器官的懸浮培養。同時，保持 37°C、5% CO?和適當的濕度，為類器官的生長提供穩定的環境。

細胞間相互作用的維持

模擬體內細胞通訊：在類器官培養中，要考慮神經母細胞瘤細胞之間以及與周圍支持細胞（如神經膠質細胞）的相互作用。可以通過共培養的方式，加入適當比例的支持細胞，模擬體內的細胞通訊網絡，促進類器官的成熟和功能維持。

細胞信號通路的調節：調節細胞間的信號通路，如 Notch、Wnt 等信號通路，這些通路在神經母細胞瘤的細胞增殖、分化和自我更新中發揮關鍵作用。通過添加信號通路的激動劑或拮抗劑，可以控制類器官的生長和分化狀態。